Potential role of MIC25 in mitochondrial remodelling during neuronal development

Abstract

Mitochondria are known as organelles responsible for providing energy to the cell, to fuel all daily activities. Mitochondrial inner membranes increase surface area by forming intricate folds, the so-called cristae. Different protein distributions across cristae mark different membrane regions: oligomeric F1F𝑜-ATP synthase complexes at the tips, proteins of the electron transport chain along the sides, and the mitochondrial contact site and cristae organising system (MICOS) at crista junctions that form a transition zone between cristae and the inner boundary membrane. The MICOS complex is organised into a MIC60- and MIC10-subcomplex harbouring MIC60, MIC19 and MIC25 as components of the former, and MIC10, MIC26, MIC27 and QIL1 of the latter. MICOS is required to maintain the strong negative membrane curvature at crista junctions and to form elaborate supercomplexes with proteins of the outer mitochondrial membrane. Such networks of partner proteins implicate MICOS in vital processes, like mitochondrial protein import and metabolite homeostasis. As knowledge about the MICOS complex increases, questions about tissue-specific properties and its adaptation to special energy quests are arising. Previous data from our research group indicated that the MIC25 subunit of MICOS was explicitly upregulated in brain tissue samples of mice. This work makes use of a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) to gain insights into structural, and functional changes of mitochondrial membrane shaping complexes during differentiation of SH-SY5Y cells into consecutive neuronal states. A major focus was the behaviour of the candidate protein MIC25, which was studied in SH-SY5Y as well as in human embryonic kidney cells (HEK293T) for comparison. My data reveal significantly increased expression levels of MIC25 in SH-SY5Y cells upon differentiation in line with a role of MIC25 in mitochondrial adaptive responses during neuronal development. Remarkably, changes in MIC25 expression were found to be independent of the levels of other MICOS-subunits. Analysis of mitochondrial protein complexes by native electrophoresis and immunoprecipitation disclosed, that MIC25 was increasingly incorporated into the mitochondrial intermembrane space bridging (MIB) complex formed by MICOS and the SAM complex of the outer membrane. Bioenergetic measurements revealed that differentiated SH-SY5Y cells lacking MIC25 exhibit a reduced spare capacity for oxygen consumption, increased glycolytic activity and hyperpolarisation of mitochondrial inner membranes. By contrast, MIC25-deficient HEK293T cells showed no measurable differences in OXPHOS performance, but a moderate drop in membrane potential. In summary, my work sheds first light on the differential behaviour and specific features of MICOS, specifically MIC25, in different cell types and tissues. It strengthens the idea that the MIC25 subunit may have a specific role in neuronal cells and/or neuronal tissue development. Further experiments will show, how loss of MIC25 affects specific cellular properties and responses during adaptive cellular processes and what triggers the strong induction of MIC25 in early developmental phases.

Mitochondrien sind als jene Zellorganellen bekannt, die Energie für nahezu alle zellulären Prozesse bereitstellen. Die innere Membran der Mitochondrien formt Einstülpungen, die sogenannten Cristae, welche die Oberfläche vergrößern. Entlang dieser Cristae lassen sich verschiedene Proteinverteilungen feststellen: oligomerische F1Fo-ATP Synthasen befinden sich an den Spitzen, die Proteine der Atmungskette entlang der Seiten, und der Mitochondrial Contact Site and Cristae Organising System (MICOS)-Komplex im Bereich der Crista Junction, dem Übergang zwischen Cristae und der inneren Grenzmembran der Mitochondrien. Der MICOS-Komplex organisiert sich in einen MIC60- und MIC10-Subkomplex. Während zum MIC60-Subkomplex MIC60, MIC19 und MIC25 gezählt werden, werden MIC10, MIC26, MIC27 und QIL1 zum MIC10-Subkomplex gerechnet. MICOS ist von Bedeutung dafür, die negative Krümmung der inneren Mitochondrienmembran im Bereich der Crista Junctions aufrechtzuerhalten, sowie gemeinsam mit Proteinen der äußeren Mitochondrienmembran Superkomplexe zu bilden. Darüber hinaus ist MICOS am Proteinimport sowie an der Regulation ausgeglichener metabolischer Profile beteiligt. Mit dem Wissenszuwachs über MICOS entwickeln sich neue Forschungsfragen zu gewebsspezifischen Eigenschaften und der Anpassung an zellspezifische Energiebedarfe des Komplexes. Bereits erhobene Daten aus unserer Forschungsgruppe weisen darauf hin, dass die MIC25-Untereinheit von MICOS spezifisch in Gewebeproben von Mausgehirnen verstärkt exprimiert wird. Dabei untersucht diese Arbeit strukturelle und funktionelle Veränderungen der Mitochondrienmembran-gestaltenden Proteinkomplexe. Menschliche Neuroblastomzellen (SH-SY5Y) wurden hierfür zu adulten Neuronen differenziert. Dabei lag der Fokus auf dem Protein MIC25, dessen Eigenschaften in SH-SY5Y und Human Embryonic Kidney Cells (HEK293T) verglichen wurden. Meine Arbeit zeigt eine signifikant erhöhte Expression von MIC25 in differenzierten SH-SY5Y-Zellen, die auf eine Rolle von MIC25 bei der Anpassung von Mitochondrien an die Umgebung während neuronaler Entwicklungsprozesse hindeutet. Es ist bemerkenswert, dass die verstärkte Expression von MIC25 unabhängig von den Expressionsniveaus der anderen Proteine des MICOS-Komplexes war. Die Auswertung von mitochondrellen Proteinkomplexen mittels Elektrophorese und Immunopräzipitation ergab, dass MIC25 verstärkt in den Mitochondrial Intermembrane Space Bridging (MIB)-Komplex eingebaut wird, welcher durch MICOS und den sogenannten SAM-Komplex der äußeren Mitochondrienmembran gebildet wird. Bioenergetische Messungen ergaben, dass differenzierte SH-SY5Y Zellen mit verminderter Expression von MIC25 eine reduzierte relative Reservekapazität für den Sauerstoffverbrauch, erhöhte Glykolyseaktivität und Hyperpolarisation des Membranpotenzials der inneren Mitochondrienmembran haben. HEK293T-Zellen mit verminderter Expression von MIC25 zeigten keine Unterschiede in der Funktion der Atmungskette, allerdings eine Verminderung des Membranpotenzials. Zusammenfassend liefert diese Arbeit erste Einblicke in die zell- und gewebespezifischen Eigenschaften des MICOS-Komplexes im Allgemeinen und von MIC25 im Speziellen. Sie bestärkt die These, dass MIC25 eine individuelle Rolle in neuronalen Zellen und/oder deren Entwicklung spielt. Das Ziel weiterer Forschung wird es sein zu zeigen, wie der Expressionsverlust von MIC25 verschiedene Zelleigenschaften und Anpassungsprozesse beeinflusst. Eine zentrale anschließende Frage lautet, welche Faktoren die starke Expressionszunahme von MIC25 in frühen Entwicklungsstadien auslösen.